Flowcytometri (FCM). Flowcytometri er en hurtig, objektiv og kvantitativ metode til analyse og separation af celler i suspension. Princippet er ganske enkelt. De celler eller partikler, der ønskes analyseret, bringes i suspension som enkelt-partikler og føres i en væskestrøm én for én forbi en lysstråle (typisk en 488 nm laser), hvorved der fra hver enkelt partikel udsendes pulser af spredt lys og fluorescens. Hvis et fluorescerende farvestof er bundet specifikt og proportionalt til en bestemt komponent i en celle, f.eks. ved immunokemisk farvning, vil den målte fluorescenspuls repræsentere mængden af den pågældende komponent i denne celle. Resultatet udtrykkes i et histogram som den relative fordeling af den pågældende komponent inden for den målte population af celler.

Med flowcytometri er det muligt simultant at måle en række forskellige egenskaber for hver enkelt celle (multiparameter analyse). Celleprøven kan være farvet med flere antistoffer mod flere forskellige antigener, og således at hvert antistof kan skelnes på en bestemt fluorescensfarve (FITC, phycoerythrin m.fl.) . Idet værdierne af hver parameter for hver enkelt målt celle bliver lagret i en computer (list mode), er det muligt at undersøge forskellige markørers indbyrdes fordeling imellem cellerne i den målte population. Sammenhængen mellem flere parametre undersøges ved, at man først definerer en subpopulation ud fra et sæt af kendte parametre (gates, bitmaps) og derefter bruger disse kvantitative selektionskriterier til sortering (gating, back-gating) af det elektronisk lagrede datasæt for at opnå den ønskede grafiske og statistiske information om den pågældende subpopulations ukendte fordeling i andre parametre.

Cellulær heterogenitet kan på denne måde beskrives kvantitativt, og subpopulationer med bestemte sæt af egenskaber kan diskrimineres. Multiparameter flowcytometri giver derfor gode muligheder for at beskrive de komplicerede forhold mellem cellers aktivering, proliferation, differentiering, modning og endelige opløsning, der findes i heterogene cellepopulationer som f.eks. i blod og knoglemarv med deres forskellige differentieringslinier eller i kræftsvulster med abnorme subkloner i blanding med normale celletyper. Ulemper ved flowcytometrisk undersøgelse er f.eks., at det er vanskeligt at præparere solide væv til suspensioner af intakte enkeltceller, at vævstopografien går tabt, og at det i et almindeligt flowcytometer ikke er muligt efter måling at genfinde hver enkelt celle med henblik på yderligere undersøgelser.

Flowsortering (fluorescensaktiveret cellesortering, FACS). En flowsorter er et specielt bygget flowcytometer, hvori individuelle celler kan adskilles fysisk fra resten af cellepopulationen. Ethvert sæt af kriterier, som kan defineres i relation til den flowcytometriske analyse, kan benyttes til at udløse sorteringsbegivenheden for den individuelle celle eller partikel. Ingen anden metode end flowsortering kan separere levende celler ud fra deres kvantitative expression af bestemte molekyler eller ud fra en forud fastlagt kvantitativ kombination af egenskaber. På dette grundlag kan flowsortering benyttes som del af en analytisk strategi. Især til præparative formål kan det være fordelagtigt at kombinere flowsorting (serielle begivenheder) med en masseseparationsmetode (parallelle begivenheder). I visse tilfælde kan den samlede sorteringsproces effektiviseres afgørende med en forudgående immunomagnetisk separation.

Imagecytometri. For vævsanalyse er kvantitativ imagecytometri, baseret på scanning af stationære præparater, en vigtig modpart til flowcytometri. Ved imagecytometri kan de individuelle celler genfindes og undersøges igen efter fornyet farvning, således kan man f.eks. korrelere parametre for den levende celle med parametre, der kun kan måles efter fiksering eller permeabilisering. Til sortering af celler fra vævsstrukturer er lasermikrodissektion en vigtig modpart til flowsortering.

 

DNA-flowcytometri. Flowcytometrisk DNA-analyse har talrige anvendelser inden for biologisk og medicinsk forskning, diagnose og terapi, føde- og miljøkontrol, m.v. Flowcytometri er kendt som en hurtig, objektiv og kvantitativ metode til måling af celler eller andre partikler i suspension, baseret på et ganske enkelt princip, men cellepræparationen og dataanalysen kan være kompliceret og tidsrøvende. Mange typer af biologiske partikler kan analyseres for DNA-indhold, således både eukaryote og prokaryote celler, cellekerner, kromosomer, vira og DNA-fragmenter (detektionsgrænse 5-100 kB). Der findes en række forskellige procedurer for analyse af DNA-ploidi, cellecyklus, DNA-syntese, cytogenetiske aberrationer, mikrobiel artsbestemmelse, m.v. Ved DNA-analyse af tumorvæv til påvisning af DNA-aneuploide subkloner (detektionsgrænse for DNA-forskel er 2-3 %) forudsættes justering af flowcytometeret til højest mulig præcision (CV 1-2 %) samt brug af interne standarder. I fortolkningen af resultaterne må man være opmærksom på betydningen af vævsheterogenitet og begrænsninger i DNA-farvningens specificitet og støkiometri. DNA-fluorokromerne har forskellige egenskaber med hensyn til excitations- og emissionsspektrum, fluorescensintensitet, AT/CG specificitet, bindingstype (kovalent eller interkalerende), kromatinstrukturafhængighed, membranpermeabilitet evt. efflux og uspecifik binding til RNA. Hoechst 33342 og DRAQ5 kan benyttes til vitalfarvning. DNA-farvning kan også udføres indirekte ved FISH-teknik. I visse henseender kan støkiometriske afvigelser være nyttige. Kombination af specifik AT- og CG-farvning kan benyttes ved flowcytometrisk kromosomanalyse. DNA-fluorescensintensiteten ændres, hvis thymidin substitueres med bromodeoxyuridin (BrdU) i DNA-syntetiserende celler, hvilket udnyttes til analyse af celleproliferation. I en multivariat analyse kan DNA kombineres med én eller flere andre parametre, heriblandt immunokemiske markører for celleproliferation (BrdU), celledifferentiering, celleaktivering, cellefunktioner og celledød. Sættet af markører og fluorokromer skal passe til flowcytometrets optiske konfiguration (f.eks. FITC/PI og FITC/PE/DRAQ5). Med flowcytometrisk bead-array analyse, hvor signalet bygges op ved hybridisering til specifikke oligonukleotid prober på et panel af størrelses- og fluorescenskodede syntetiske partikler, kan man undersøge indholdet i en væskeprøve af et stort antal forskellige nukleotidsekvenser (mutationsanalyse, SNP).

 

Sidst revideret 27. september 2002  /JKL